荧光原位杂交(FISH)滤光片

荧光原位杂交(FISH)

荧光原位杂交 (Fluorescence In Situ Hybridization, FISH) 是指利用荧光染料标记的，已知序列的单链核酸作为探针，通过碱基互补配对原则，与待检样品中核酸进行特异性结合，然后通过观察荧光信号，从而对样品中待检核酸进行定性，定量及定位分析。FISH 具有快速，信号强，特异性高以及可以多重染色等特点，广泛应用于产前诊断，基因组结构分析等领域。

影响FISH 结果的因素有很多，包括样品准备和处理，显微镜，光源，荧光探针以及滤光片。FISH 通常基于荧光显微镜来观测信号，所用滤光片包括激发片，二向色镜和发射片三种。其工作原理如下图所示:

l                      激发片：选择透过光源某部分波段的光，用来激发荧光探针；

l                      二向色镜：反射光源的光至样品，透过产生的荧光并反射激发光的散射光；

l                      发射片：选择透过荧光的某部分波段的光至检测器或人眼，并可以阻挡掉激发光的杂散光。

在 FISH 实验中，滤光片带宽的大小会对 FISH 图像的对比度产生重要的影响。增加带宽会提高激发和接收效率，使接收的信号增强。但实际接收的信号中同时包含了探针的荧光信号和样品的背底噪音，带宽的增加会同时增加这两者的强度。带宽减小，虽然可以降低背底噪音的强度，但荧光信号也会随之减弱 。所以对于对比度要求很高的FISH 实验，针对于每种具体的染料，都会存在一个*的带宽，使 FISH 图像能够达到*的对比度。FISH 滤光片的带宽都是根据常用的 FISH 染料做过优化，可以为用户的 FISH 实验提供*的图像对比度。

"B" 的信号比"A" 多91%, 但是“B" 的噪音比“A" 多226%。“A"具有更好的对比度！

FISH 滤光片组具有以下特点 :

l                      高透过率、高截止深度和高光谱陡度；

l                      保证足够亮度的同时，提供*的图像对比度；

l                      消除串色的影响；

a. 消除Gold 和Aqua 串色到Green 通道；

b. 消除Gold 和Orange 串色到Red 通道；

l                      对多波段滤光片组中的DAPI 通道进行特殊处理，避免DAPI 信号过强而将其他通道信号掩盖；

l                      多色图像叠加零漂移；

l                      磁控溅射镀膜，终身质保。

ET 系列 - FISH 单波段带通滤光片组

ET 系列 - FISH 多波段滤光片组

DAPI 是一种能够与DNA双链特异性结合的有机荧光染料。在 FISH 实验中，DAPI 主要用来对整个细胞核进行染色成像，这就导致了 DAPI 的浓度要远高于其他 FISH 探针的浓度。而在有些 FISH 实验流程中，DAPI 是在最后一步进行染色，染色之后也没有清洗的步骤。

在使用多波段滤光片进行多色 FISH 实验中，为了避免DAPI 的信号将其他 FISH 探针的信号掩盖，在 多波段滤光片组中，会刻意降低激发片在 DAPI 处的透过率，从保证 DAPI 的信号不至于过高（见下图）。

DAPI 和 Aqua 的发射峰高度重叠，通常情况下同时做两种探针的成像会很困难，因为大量的 DAPI 信号会将 Aqua 信号掩盖掉。

69014 滤光片组，通过降低 DAPI 的激发效率，能够实现DAPI，Aqua，Green 和 Orange 四色的同时观察。 DAPI 和Aqua 采用不同的激发波段，但共享同一个接收通道（见下图）。

ET 系列 - FISH 多波段滤光片组

1. 为保证 Green 和 Orange 强度接近，59011 适用于汞灯和卤素灯光源，59012 适用于 LED 光源；

2. 含一个双波段激发片，用于同时激发 Green 和 Orange；一个三波段激发片，用于同时激发 DAPI，Green 和 Orange；三个单波段激发片，用于 分别激发 DAPI，Green 和 Orange；

3. 含一个双波段激发片，用于同时激发 Green 和 Red；一个三波段激发片，用于同时激发 DAPI，Green 和 Red；三个单波段激发片，用于分别 激发 DAPI，Green 和 Red。